【耳蜗类器官】复旦团队揭示PKM2乳酸依赖调控耳蜗类器官发育机制
【耳蜗类器官】复旦团队揭示PKM2乳酸依赖调控耳蜗类器官发育机制
葡萄糖代谢在哺乳动物耳蜗发育中的作用和机制仍然难以捉摸。复旦大学李华伟教授团队在《PNAS》期刊发表了最新研究成果，通过使用耳蜗类器官和转基因小鼠，揭示了丙酮酸激酶M2（PKM2）依赖性糖酵解代谢在人工耳蜗发育中的重要作用，并为毛细胞再生提供了潜在的靶点。
文章介绍
· 题目：PKM2通过乳酸依赖性转录调控控制耳蜗发育
· 杂志：Proc Natl Acad Sci USA
· 影响因子：9.4
· 发表时间：2025年1月
#1
研究背景
Background
内耳发育中的代谢过程对于确定毛细胞再生靶点至关重要，代谢选择在细胞增殖和分化中起着关键作用。在众多代谢过程中，越来越多的证据表明葡萄糖代谢与器官发育密切相关。然而，葡萄糖代谢在哺乳动物内耳发育和毛细胞再生中的作用仍不清楚。本研究发现，糖酵解代谢在小鼠和人类耳蜗前感觉上皮扩展期间高度活跃，且主要由PKM2调控。PKM2的缺失会导致代谢从糖酵解转向氧化磷酸化，从而损害耳蜗类器官的形成和感觉上皮的形态发生。PKM2催化生成的乳酸通过乳酸化修饰组蛋白H3（H3K9la），调控Sox家族转录因子的表达，进而影响耳蜗发育。在支持细胞中过表达PKM2可触发代谢重编程并促进毛细胞生成。这些发现为毛细胞再生提供了新的分子机制和治疗思路。
#2
研究思路
Methods
本研究利用耳蜗类器官培养系统发现，经典的糖酵解级联反应和关键酶PKM2被强烈激活；构建了PKM2条件性敲除（CKO）小鼠系，并与Foxg1-Cre和Sox9-CreER小鼠杂交，以特异性删除耳蜗前体细胞中的PKM2，阐明PKM2在耳蜗发育中的作用和机制；通过RNA测序（RNA-seq）和CUT&Tag技术，发现乳酸介导的表观遗传修饰显著改变了耳蜗基因表达模式。最后证明了过表达PKM2以及外源性乳酸给药能够增强耳蜗中的毛细胞再生。
#3
研究结果
Results
1.耳蜗类器官扩增过程中糖酵解代谢升高
为了探索耳蜗细胞再生的潜在靶点，通过不同培养系统对Lgr5+NSEC来源的耳蜗类器官进行培养，并分析了其转录组数据。使用了4种3D培养条件：EFI、EFI-C、EFI-CVP6和EFI-CL。结果表明，在EFI-CL条件下，NSEC表现出最强的类器官形成能力。随后进行了整体RNA测序，比较了EFI-CL条件下扩展的类器官与原始内耳神经干细胞（NSEC）的基因表达差异。通过GO分析发现“对糖苷的反应”是上调基因最富集生物过程。GSEA显示，经典的糖酵解过程及NADH再生过程在类器官组中显著富集，而与线粒体呼吸链相关的基因则显著下调。因此以上发现促使我们确定哪个葡萄糖代谢过程参与了类器官扩增。
在耳蜗类器官的扩展和分化过程中，糖酵解代谢在类器官扩展阶段发挥关键作用。通过Seahorse分析发现，EFI-CL培养条件下的类器官显示出最高的胞外酸化率（ECAR），且糖酵解能力在奥利霉素（一种抑制线粒体ATP合成的抗生素）处理后没有进一步增加，而2-DG（一种不可代谢的葡萄糖类似物）处理则显著降低了ECAR。质谱分析显示，EFI-CL组的类器官中ATP/ADP、NADH/NAD等能量代谢相关物质水平升高，表明其具有较高的能量需求和快速的生物合成。同时，糖酵解中间产物如F6P、FBP、PEP和丙酮酸等在EFI-CL组中积累，提示糖酵解代谢在耳蜗类器官扩展中起到了重要作用。随着类器官分化的推进，线粒体氧化呼吸增加，表明分化过程中转向了氧化磷酸化（OXPHOS）的代谢方式（图1）。
图1 糖酵解代谢在耳蜗类器官扩增过程中被激活
2. PKM2活性对于耳蜗类器官扩展是必需的
为了探讨糖酵解代谢对NSEC增殖的调节作用，通过使用丙酮酸（PYR）和乳酸（LAC）处理类器官，研究发现这两种代谢物能够促进类器官的形成，增加类器官大小和细胞活力。在促增殖条件下，Pkm基因在类器官中的表达显著上调，特别是PKM2蛋白在扩展的类器官和耳蜗上皮中大量表达。此外，PKM2的表达在增殖的培养系统中也显著升高。以上结果表明，PKM2在糖酵解代谢和类器官扩展中具有关键作用。
为了研究PKM2在耳蜗类器官形成中的生理作用，通过去除Pkm基因的第9外显子，生成了PKM2条件性敲除小鼠，并通过交配构建了缺乏PKM2蛋白的NSEC小鼠模型。通过Cre介导的重组确认了PKM2在耳蜗类器官中的缺失。ECAR分析显示，PKM2缺失导致糖酵解活性受损，并且OXPHOS水平升高。PKM2缺失的类器官中，NSEC的增殖能力显著降低。进一步使用PKM2的激动剂TEPP-46和抑制剂Compound 3 K，结果证实了PKM2的代谢活性对耳蜗类器官的扩展至关重要（图2）
图2 PKM2控制糖酵解通量和类器官形成
3. PKM2对于小鼠耳蜗的感觉上皮形态发生至关重要
为了评估PKM2在耳蜗形态发生中的作用，研究PKM2在胚胎发育时期中耳蜗扩展阶段的表达。结果显示，在胚胎发育的早期阶段第9.5天（E9.5），PKM2的表达较为丰富，但从E9到E16.5 PKM2表达随着发育进程逐渐下降。使用Foxg1-Cre小鼠进行PKM2条件性敲除实验，发现PKM2缺失导致耳泡变小，并且SOX2+祖细胞数量减少。在P2阶段，PKM2缺失小鼠的耳蜗整体大小减小，包括耳蜗的高度、宽度、上皮的螺旋长度以及耳蜗上皮的长度。在PKM2条件敲除小鼠中，P2时耳蜗毛细胞数量显著减少，尤其是内毛细胞减少和外毛细胞在耳蜗顶端缺失严重，同时立体纤毛形态和定向异常。RNA-seq分析显示，PKM2缺失导致2,634个基因下调和2,744个基因上调，且下调基因与多细胞生物发育、细胞增殖、内耳发育等过程相关。研究表明，PKM2驱动的糖酵解对耳蜗感觉上皮的形态发生至关重要（图3）。
图3 PKM2调节耳蜗感觉上皮的发育
４.乳酸促进耳蜗类器官的扩增
进一步评估了糖酵解衍生的代谢产物，以表征哪些代谢物驱动耳蜗形态发生。通过监测小鼠胚胎葡萄糖摄取，发现E9.5时耳泡和神经板的葡萄糖摄取信号显著，之后随着发育逐渐减少，表明葡萄糖代谢在耳蜗谱系的早期建立和扩展中起重要作用。在耳蜗类器官中，葡萄糖摄取信号在扩展期增强，分化时减弱。通过靶向质谱分析，发现PKM2缺失导致糖酵解中间产物积累，而PYR、LAC和柠檬酸（CIT）水平降低。13C标记葡萄糖追踪实验显示PKM2缺失显著减少了M+6 GLU摄取，但葡萄糖摄取速率无显著变化。总的来说，PKM2缺失导致代谢程序转变，影响了耳蜗形态发生。
研究发现外源性ATP无法恢复PKM2缺失引起的类器官生长受限，因此转向代谢产物乳酸的作用研究。结果表明，乳酸能够以剂量依赖的方式改善PKM2缺失导致的类器官扩展受限，并且能够逆转PKM2缺失引起的NSEC细胞周期S/G2/M期停滞。此外，乳酸脱氢酶抑制剂的使用抑制了类器官形成，证明PKM2生成的丙酮酸主要转化为乳酸。以上结果表明，糖酵解生成的乳酸作为一种功能性代谢产物调节了耳蜗感觉上皮的发育（图4）。
图4 糖酵解通量追踪显示乳酸控制内耳发育
5. H3K9的乳酰化介导全基因组转录修饰
研究表明，乳酸通过赖氨酸乳酸化（Kla）影响内耳发育，但NDRG3和ERK在乳酸调控内耳发育中的作用未见明显变化。PKM2依赖的Kla修饰主要集中在组蛋白区域，乳酸处理能够部分恢复PKM2缺失导致的H3K9la下降。乳酸处理后还增加了类器官中的Pan-Kla、H3K9la、H3K27la、H4K8la和H4K12la水平。通过抑制p300酰基转移酶，验证了PKM2通过p300/CBP机制促进乳酸化。研究推测，H3K9la参与乳酸介导的耳蜗发育。
通过CUT&Tag实验分析H3K9la在基因组范围内的修饰，发现H3K9la主要发生在启动子区域，并且PKM2缺失和乳酸处理会改变这些区域的结合模式。PKM2缺失导致418个与H3K9la结合的基因表达降低，而乳酸处理能够恢复这些基因的表达，且这些基因与大脑发育和感觉器官形态发生等发育过程相关。进一步的分析显示，PKM2缺失下调的基因、H3K9la结合基因表达减少的基因和乳酸处理恢复的基因取交集，结果共有80个基因差异性表达。在80个共有基因中，对具有显著差异峰值的峰区域进行从头基序分析，发现这些基因的调控可能与Sox转录因子家族成员（如Sox15和Sox13）、Wnt9a、Elf3和Ebf3相关。
通过RNA-seq数据验证了Sox家族基因（如Sox2、Sox4、Sox9、Sox21）显著下调。研究发现Sox2和Sox9在启动子区域与H3K9la结合的峰值在PKM2缺失后减少，乳酸处理恢复了这些峰值，且通过ChIP-qPCR验证了启动子区域的变化。进一步分析显示，共有基因（如Aif1l和Rflna）的启动子区域也发生了峰值变化，而Sox21、Sox15和Elf3的外显子和非编码区域的峰值也有变化。这些结果表明，H3K9la与PKM2调控的基因染色质状态密切相关，可能在糖酵解-乳酸级联反应触发感觉上皮形态发生中发挥重要作用（图5）。
图5 PKM2-乳酸级联反应驱动的H3K9乳酸化修饰
6. PKM2过表达和乳酸促进人类和小鼠的毛细胞生成
通过与选择性γ-分泌酶抑制剂LY411575（LY）联合使用，PKM2过表达或乳酸添加显著促进了毛细胞的生成，主要为支持细胞转分化为毛细胞。EdU追踪显示，毛细胞的生成主要依赖转分化而非有丝分裂。此外，LC-MS分析确认PKM2促进了丙酮酸和乳酸的产生，表明糖酵解激活的代谢重编程有助于毛细胞再生。
该研究通过将PKM2载体AAV2/DJ注入新生小鼠内耳，结果表明PKM2过表达与LY联合使用能够显著增加毛细胞的数量。利用人类胚胎耳蜗样本，研究表明PKM2在毛细胞生成的关键阶段表达逐渐下降，且在胚胎9周时耳蜗的葡萄糖摄取能力较强。通过构建人类PKM2过表达病毒并培养12周人类耳蜗标本，发现与单独LY处理相比，PKM2过表达或乳酸补充能显著增加毛细胞生成。以上结果表明，靶向PKM2-乳酸级联反应有望成为促进毛细胞再生的治疗策略（图6）。
图6 PKM2过表达和乳酸处理促进了人类毛细胞的生成
小结
本研究揭示了PKM2依赖的糖酵解通过调控H3K9la乳酸化及染色质状态的改变，进而调控耳蜗感觉上皮的形成并启动转录过程。此外，PKM2介导的代谢重编程显著促进了人类耳蜗毛细胞的生成，为听力功能恢复的再生机制提供了新的理论依据和研究思路。
参考文献
Wu, Mingxuan et al. “PKM2 controls cochlear development through lactate-dependent transcriptional regulation.” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America vol. 122,2 (2025): e2410829122. doi:10.1073/pnas.2410829122
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