类器官研究：一种创新双特异性抗体，攻克Her2阳性胃癌耐药难题
类器官研究：一种创新双特异性抗体，攻克Her2阳性胃癌耐药难题
文章介绍
2023年8月，浙江大学医学院附属第一医院滕理送、周全研究团队在期刊Advanced Science（IF14.3）发表了一篇题为“Anti-PD-1/Her2 Bispecific Antibody IBI315 Enhances the Treatment Effect of Her2-Positive Gastric Cancer through Gasdermin B-Cleavage Induced Pyroptosis”的文章。
#1
Abstract
大多数人类表皮生长因子受体2（Her2）阳性的胃癌患者对Her2靶向治疗产生耐药性，其中免疫检查点的上调起着关键作用。在此背景下，科研团队研发了一种重组全人IgG1双特异性抗体IBI315，该抗体同时靶向PD-1和Her2，并对其抗肿瘤效果及其潜在机制进行了研究。IBI315促进了Her2阳性肿瘤细胞与PD-1阳性T细胞之间的物理相互作用，与每种亲本抗体或其组合相比，在体内外使用患者来源的异种移植物和类器官重建的人免疫细胞小鼠肿瘤模型中，均显著增强了抗肿瘤效果。此外，IBI315治疗还能诱导肿瘤中免疫细胞的募集和活化。从机制上讲，IBI315触发肿瘤细胞中的gasdermin B（GSDMB）介导的细胞焦亡，导致T细胞的活化和募集。活化的T细胞分泌IFNγ，增强GSDMB的表达，从而建立了一个T细胞活化和肿瘤细胞杀伤的正反馈循环。值得注意的是，Her2阳性的胃癌细胞中GSDMB的表达水平升高，这为IBI315的疗效提供了理论依据。本研究支持IBI315作为一种有前景的双特异性抗体为基础的免疫治疗方法，用于Her2阳性的胃癌，为这类患者群体的治疗前景开辟了更广阔的道路。
#2
Methods
这篇研究旨在探讨一种新型的双特异性抗体IBI315，其靶向PD-1和Her2，以增强对Her2阳性胃癌的治疗效果。研究首先通过体外实验和动物模型验证了IBI315对肿瘤的抗增殖作用，进一步发现其通过诱导气孔蛋白B介导的pyroptosis途径，促进肿瘤细胞的凋亡和促炎反应，从而增强了免疫细胞的浸润和活化。研究方法涉及体外细胞培养实验、动物模型实验以及免疫细胞活化的检测等。通过这些实验手段，研究揭示了IBI315的潜在机制，并为其在提高Her2阳性胃癌治疗中的应用提供了重要的实验依据。
#3
Results
· IBI315诱导PD-1和Her2的结合，并介导T细胞对Her2阳性胃癌细胞的细胞毒性作用IBI315在Her2阳性胃癌和类器官中展现出强大的抗肿瘤效果
· IBI315在存在T细胞的情况下诱导Her2阳性胃癌细胞发生焦亡
· IBI315的抗肿瘤效果取决于GSDMB裂解诱导的焦亡
· IBI315介导的肿瘤细胞焦亡激活淋巴细胞，触发肿瘤抑制的积极循环
图1IBI315诱导PD-1和Her2的结合并介导T细胞对Her2阳性胃癌细胞的细胞毒性作用。A-C) N87细胞用细胞追踪Deep Red标记，活化T细胞用Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)标记。它们以1:1的比例共培养，并给予IBI315、其亲本抗体或其组合治疗30分钟。使用流式细胞术分析N87细胞与活化T细胞之间的结合率。A)示意图显示IBI315与T细胞上的PD-1和肿瘤细胞上的Her2的结合。B)代表性流式细胞术图像显示用T+P或IBI315治疗的N87细胞(用细胞追踪Deep Red染色)和活化T细胞(用CFSE染色)。C)根据流式细胞术分析，显示了具有上述处理的关联细胞的定量数据(散点图上方的右象限)。D,E)研究了IBI315、亲本PD-1抗体、亲本曲妥珠单抗以及亲本药物组合对人类T细胞分泌D)IFNγ和E)IL-2的影响，使用混合淋巴反应(MLR)检测。F-I) Her2阳性胃癌细胞(N87和SNU-216)在存在T细胞的情况下给予IBI315、其亲本抗体或其组合治疗24小时。展示了F) N87/T细胞和G) SNU-216/T细胞共培养系统的代表性图像，其中白色箭头表示与肿瘤细胞相关的T细胞。H) N87/T细胞和I) SNU-216/T细胞共培养系统中肿瘤细胞死亡的定量数据，通过LDH释放测量，展示了上述处理的效果。比例尺50 µm。所有统计结果来自三独立实验，并以均值±SEM表示。缩写：TZB：曲妥珠单抗，αPD1：抗PD1抗体(sintilimab)，T+P：曲妥珠单抗+sintilimab。
图2 IBI315在Her2阳性的胃癌和类器官中显示出强大的抗肿瘤功效。A-H)具有N87肿瘤或患者来源的异种移植(PDX-1)的人免疫细胞重建的NOG小鼠，分别给予IBI315、其亲本抗体或其组合治疗。 A)第31天的N87肿瘤照片记录和B)相应的平均肿瘤体积。 C)此外，监测每组的体重变化。 D)免疫组织化学分析显示了N87肿瘤中每个治疗组代表性CD3+、CD8+和CD4+ T细胞浸润图像，E)进一步定量。 F)PDX-1的组织病理学检查包括H&E和Her2染色，以及G)第39天的照片记录和H)平均肿瘤体积的评估。 I-K)建立了类器官PDXO-1和T细胞的共培养系统，以评估由IBI315、其亲本抗体或其组合引起的肿瘤细胞死亡，通过测量LDH释放来确定。 I)对类器官PDXO-1进行组织学分析，包括H&E染色、Her2染色和明亮场(BF)成像。 J)显示了在指示治疗下PDXO-1/T细胞共培养系统的代表性图像，特别关注IBI315治疗的PDXO-1，展示了T细胞与PDXO-1之间的关联。 K)在指示治疗下与T细胞共培养24小时后，通过测量LDH释放来量化PDXO-1的细胞死亡程度。比例尺50 µm。所有统计结果来自三独立实验，并以均值±SEM表示。缩写：TZB：曲妥珠单抗，αPD1：抗PD1抗体(sintilimab)，T+P：曲妥珠单抗+sintilimab。
图3 IBI315在T细胞存在下诱导Her2阳性胃癌细胞发生细胞焦亡。A-C) N87或SNU-216细胞用CFSE预标记，并与T细胞在IBI315、其亲本抗体或其组合物存在下共培养6小时。获取荧光图像以说明肿瘤细胞的形态变化，并测量肿瘤细胞/T细胞共培养系统上清液中IL-18的水平。A)用箭头标示的N87或SNU-216细胞的代表性图像。B)以柱状图的形式显示经不同抗体处理后细胞焦亡细胞的定量。C)显示经不同处理后肿瘤细胞/T细胞共培养系统上清液中IL-18的水平。D-G)检测N87、SNU-216细胞和PDXO-1中GSDMB的表达，并观察其在T细胞存在下经IBI315处理6小时后的裂解情况。D)用荧光染色法观察N87细胞中Her2(绿色)和GSDMB(红色)的共表达。E)通过免疫组织化学染色评估PDX-1和PDXO-1中GSDMB的表达。F)通过免疫印迹法评估N87和SNU-216细胞中Her2和GSDMB的表达。G)通过免疫印迹法评估在肿瘤细胞/T细胞共培养系统中经IgG或IBI315处理6小时后GSDMB的裂解情况。H-J)评估来自接受与图2相同给药方案的肿瘤中肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)中参与GSDMB裂解诱导细胞焦亡的酶granzyme A的表达模式。H) 免疫组织化学染色显示，在接受IBI315治疗的N87肿瘤的TIL中，CD3、CD8、CD4和granzyme A在同一部位表达。 I) PDX-1肿瘤被消化成单个细胞，并对TIL进行分析。通过流式细胞术测定CD8+ TIL中granzyme A+细胞的比例，并绘制代表性图表，显示在PDX-1中给予IgG或IBI315治疗的情况，并对每组进行定量分析。 J) 免疫组织化学染色图像和每个治疗组中granzyme A+ TIL的定量分析。比例尺100 µm。所有统计结果代表三个独立实验的平均值±SEM。缩写：TZB：曲妥珠单抗，αPD1：抗PD1抗体(sintilimab)，T+P：曲妥珠单抗+sintilimab。
图4 IBI315的肿瘤细胞毒性作用依赖于GSDMB裂解诱导的细胞焦亡。使用siRNA（siGSDMB-1和siGSDMB-2）下调N87和SNU-216细胞的GSDMB表达。然后将细胞用CFSE标记并与T细胞在存在IBI315或IgG的情况下共培养。进行荧光成像以可视化具有或不具有GSDMB敲除（±GSDMB）的肿瘤细胞的形态变化和肿瘤细胞（±GSDMB）/T细胞共培养系统上清液中IL-18的水平。在A）N87和C）SNU-216细胞中，使用siGSDMB-1和siGSDMB-2处理之前和处理之后进行抗GSDMB免疫印迹，以评估siRNA的效率。捕获B）预先标记的N87或D）SNU-216细胞在肿瘤细胞（±GSDMB）/T细胞共培养系统中的代表性图像，并用箭头标示细胞焦亡的细胞。E，F）进行细胞焦亡细胞和LDH释放的定量分析。G）在指示的给药下，测量肿瘤细胞（±GSDMB）/T细胞共培养系统上清液中IL-18的水平。H）使用shRNA（N87 Sh-GSDMB）在N87细胞中敲除GSDMB。NOG小鼠用人免疫细胞重建并接种N87或N87 Sh-GSDMB肿瘤，并给予IBI315或IgG治疗。在N87细胞中进行抗GSDMB免疫印迹，并在N87肿瘤中进行GSDMB和Her2染色，以确认shGSDMB的效率。I）在第29天拍摄N87肿瘤的照片，并获得相应的平均肿瘤体积。J）进行CD3+、CD8+和CD4+ T细胞浸润的免疫组织化学分析，并获得每个治疗组的代表性图像（K）。L）进一步定量分析免疫组织化学图像。所有统计结果来自三项独立实验，并表达为平均值±SEM。比例尺100µm。
图5 IBI315介导的肿瘤细胞焦亡激活淋巴细胞，触发肿瘤抑制的积极循环。A-F）使用siRNA（siGSDMB-1和siGSDMB-2）下调N87和SNU-216细胞的GSDMB表达。具有或不具有GSDMB敲除（±GSDMB）的细胞随后与T细胞进行共培养，存在IBI315或IgG 24小时，收集上清液并用作条件培养基。将外周血单核细胞（PBMCs）培养在相应的条件培养基中24小时，并分析免疫细胞的活化。A，B）代表性图像和C，D）PBMCs中CD25+ T细胞群在CD8+ T细胞中的定量（A，C）N87（±GSDMB）或（B，D）SNU-216（±GSDMB）细胞/T细胞共培养系统，具有所示处理。来自（E）所示N87或（F）SNU-216细胞的PBMC分泌的IFNγ量被测量。G-O）具有人免疫细胞重建的NOG小鼠，携带PDX-1，接受IBI315、其母抗体或其组合的治疗（遵循与图2相同的给药方案）。在第39天，小鼠被处死，肿瘤被收集并消化成单个细胞。通过流式细胞术分析PDX-1中TIL的激活。显示每个处理组PDX-1中所示TIL群体的代表性图像和定量。
图6 图示模型描绘了IBI315介导的肿瘤细胞焦亡抗肿瘤作用的机制。IBI315促进T细胞和Her2阳性肿瘤细胞之间免疫突触的形成。 granzyme A可能裂解肿瘤细胞中的GSDMB，产生N端片段，该片段在细胞膜上形成Gasdermin跨膜孔，并触发焦亡和从肿瘤细胞中释放炎症细胞因子。 这些细胞因子可以激活和招募T细胞，而激活的T细胞分泌的IFNγ可以进一步增加肿瘤细胞中GSDMB和PD-L1的表达。 肿瘤细胞中GSDMB表达的升高增加了IBI315介导的细胞焦亡的发生。 IBI315对T细胞中PD-1的阻断作用也抑制了PD-1和PD-L1之间的相互作用。 IBI315的PD-1阻断功能增强T细胞的活化并诱导更多的肿瘤细胞发生焦亡，从而形成T细胞活化和肿瘤细胞焦亡的正反馈循环。 图示模型中所有机制的组成部分均已标记，以便于理解。
总结
本研究探讨了一种新型双特异性抗体IBI315，它靶向PD-1和Her2，并证明了其通过诱导gasdermin B介导的细胞焦亡来增强Her2阳性胃癌的治疗效果的能力。发现IBI315诱导PD-1和Her2的相互作用，介导T细胞对Her2阳性胃癌细胞的细胞毒性作用，导致肿瘤细胞凋亡和免疫细胞浸润和活化。这些发现为新型免疫治疗药物的开发提供了重要的理论和实验基础，对扩大Her2阳性胃癌患者的治疗方案具有重大的临床意义。
Lin,W.,et al.,Anti-PD-1/Her2 Bispecific Antibody IBI315 Enhances the Treatment Effect of Her2-Positive Gastric Cancer through Gasdermin B-Cleavage Induced Pyroptosis. Advanced Science. Doi: 10.1002/advs.202303908 IF: 14.3 Q1
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