探索类器官前身：以不稳定的形态力学促进肠道球体的机械生物生成

探索类器官前身：以不稳定的形态力学促进肠道球体的机械生物生成 

文章介绍

2023年9月，清华大学邵玥教授团队在期刊Nature Communications（IF:16.6009）发表了一篇题为“Mechanically enhanced biogenesis of gut spheroids with instability-driven morphomechanics”的文章。

本研究介绍了一种新的生物材料系统，该系统通过机械增强组织形态发生，从人类多能干细胞中高效生成肠球体。研究结果揭示了促进球形形成的几何不敏感机制，并揭示了控制组织形态发生的机械生物学范式。

#1

摘要

Abstract

特定区域的肠道球体是胃肠道和肺部类器官的前身，对于进行基础研究和转化研究具有巨大潜力。然而，由于对肠道球体形态形态发生的控制和机制的理解不足，肠道球体的有效生产仍然具有挑战性。研究报告了一种高效的生物材料系统，称为微图案肠道球体发生器(μGSG)，通过机械增强的组织形态发生过程从人类多能干细胞中生成肠道球体。结果表明，μGSG能够促进肠道球体的形成，而不受微纹形状和大小的影响；相反，机械强制的细胞多层化和拥挤被证明是一种一般的、几何不敏感的机制，对于促进球状体的形成是必要和充分的。结合实验结果和主动相场形态力学理论，研究进一步揭示了μGSG中控制球体形态发生的不稳定驱动机制和机械敏感相图。这项工作揭示了基于组织结构和表面张力的机械生物学范式，用于控制组织形态发生并推进类器官技术的发展。

#2

研究方法

Methods

首先，研究团队使用了一种新型的生物材料系统，通过机械增强组织形态发生学，从人类多能干细胞中生成肠道类器官。

其次，研究团队对生成的肠道类器官进行了形态学和生物学特性的分析，包括球体大小、形态、细胞类型和功能等方面。

最后，研究团队还使用了多种统计学方法对实验结果进行了分析和验证，包括使用 Microsoft Excel 2019 进行数据分析、使用 GraphPad Prism8 进行差异分析、使用单因素方差分析（ANOVA）和双侧学生 t 检验进行多样本比较等。

图1 微图案肠球体发生器（μGSG）可增强人多能干细胞（hPSCs）后前肠（PFG）球体的生物生成。

a 肠管的内胚层模式和特定区域器官发生示意图。PFG：后前肠；dAFG：背前肠；vAFG：腹前肠；MHG：中后肠。b 传统的单层诱导肠管球体发育到最终内胚层（DE）中期的示意图和代表性相衬图像。比例尺：c 在 μGSG 中生成肠球形的示意图。 d PFG 球形的诱导。 e 微图案的代表性荧光图像（左）和第 5 天（中）和第 7 天（右）在 μGSG 中细胞培养的相衬图像。缩放条：f 代表性延时共聚焦显微照片，显示第 6 至 7 天的 PFG 球状体形态发生。 插图）示意图，显示为观察组织裂解而选择的光学切片。使用的是 H1 H2B-mCherry 细胞和直径为 200 μm 的 μGSG。白色箭头表示新形成的球粒。黄色箭头表示组织裂变部位。比例尺：200 μm。g 代表性相衬图像显示分别于第 7 天从单层诱导（左）和 μGSG （右）收集的 PFG 球体。比例尺：h 柱状图显示单层诱导和 μGSG 每 30 万 hPSCs 输入产生的 PFG 球形体数量，分别使用三个 hPSC 品系（iPS18、H1 和 iPSB1）。i 具有代表性的共聚焦显微照片，显示了μGSG衍生的PFG球体内所示标记物的免疫染色。DAPI（蓝色）染色细胞核。缩放条：j 散点图显示了单层诱导和 μGSG 衍生的 PFG 球状体中所示标记阳性细胞的百分比。n = 5 个独立实验。P 值采用非配对双侧学生 t 检验计算。源数据以源数据文件的形式提供。

#3

主要结果

Results

μGSG 普遍增强区域特异性肠球体的生物生成

研究团队使用了一种人类诱导多能干细胞系，通过μGSG系统，成功地生成了具有高度生物学保真度和发育潜力的肠道球体。研究还表明，μGSG系统可以通过机械增强组织形态发生学，促进肠道球体的形成，而这种机械增强作用是一种几何形态无关的机制。

图2 a-c dAFG（背侧前肠）（a）、vAFG（腹侧前肠）（b）和 MHG（中后肠）（c）球形体的诱导（上图）和具有代表性的共聚焦显微照片（下图），显示了在指定条件下球形体中指定标记物的染色情况。缩放条：d 柱状图显示使用 iPS18 细胞系，通过单层诱导和 μGSG 分别生成的 dAFG、vAFG 和 MHG 球体的归一化数量。e-g 散点图显示 dAFG（e）中 HNF1β 和 SOX2 阳性细胞的百分比，vAFG（f）中 SOX2 和 NKX2.1 阳性细胞的百分比，以及 MHG（g）中 CDX2 阳性细胞的百分比。数据以均数 ± s.d 表示。P 值采用非配对双侧学生 t 检验计算。源数据作为源数据文件提供。

图3 微图案肠球体发生器（μGSG）产生的肠球体具有区域特异性发育潜能。

a, b μGSG 衍生的 PFG（后前肠）球体（μGSG-PFG）分别分化为胃底（a）和胃窦（b）胃器官组织。c 具有代表性的共聚焦显微照片，显示由μGSG-PFG 生成的第 17 天 hFGO（人胃底胃器 官，上图）和 hAGO（人前胃器 官，下图）细胞核（DAPI）、GATA4、SOX2 和 PDX1 的染色情况。缩放条：d、e 散点图显示分别由单层-PFG 和 μGSG-PFG 分化而来的第 17 天胃底（d）和胃窦（e）类器官中 GATA4、SOX2 和 PDX1 阳性细胞的百分比。f 从 μGSG-PFG 分化而来的第 34 天 hFGO（左）和 hAGO（右）的代表性相衬图像。在 n = 3 个独立实验中观察到类似结果。g 代表性共焦显微照片显示了从 μGSG-PFG 分化而来的第 34 天 hFGO（左）和 hAGO（右）中 GATA4、CLDN18 和 PDX1 的免疫染色。在 n = 3 个独立实验中观察到类似结果。比例尺：50 μm。源数据作为源数据文件提供。

微图案几何不敏感、机械强制的细胞多层化和拥挤是增强肠道球状生物生成的必要条件和充分条件

通过在微米级别上对细胞进行机械强制，可以促进肠道球体的形成，而这种机械强制作用是一种几何形态无关的机制。此外，研究还表明，肠道球体的分裂是由一种基于不稳定性的机制驱动的，这种机制依赖于肌动蛋白机械装置和组织表面的张力积累，以控制不同形态状态之间的机械敏感性转换。

图4 机械强化的细胞多层化和拥挤是增强肠球体生物生成的必要条件。a 显示细胞在不同直径的 μGSG（微图案肠球形发生器）中培养的相位图像，d，第 5 天。比例尺：400 μm。b 在指定条件下生成的 PFG（后前肠）球形体的数量。c 相图显示第 7 天细胞在具有不同长宽比（AR）和面积的矩形微图案的 μGSG 中培养的情况。比例尺：400 μm。d 由（c）中所示的单层、圆形 μGSG （d = 400 μm）和矩形 μGSG 生成的 PFG 球体的归一化数量。e 共焦显微照片显示第 5 天在指定条件下细胞核的 X-Y 和 X-Z 切面。小麦胚芽凝集素（WGA）染色细胞膜。紫色矩形标记放大区域。白色箭头表示细胞多层化。黄色虚线表示细胞多层化的上边界。缩放条：100 μm。f n = 5 个独立实验，每个实验有两个技术重复。g 共聚焦显微照片显示第 5 天在指定条件下 μGSG 细胞核的 X-Y 和 X-Z 切面。白色箭头表示细胞多层化。紫色虚线表示细胞多层化的上边界。缩放条：100 μm。h 散点图显示第 5 天在指定条件下的菌落厚度。j n = 4 个独立实验，每个实验至少随机选择 10 个视图。k 组织厚度与（j）中所示投影核面积之间的相关性。l、m 组织芽的萌发与(l) 组织厚度（数据来自(k)）和(m) 投影核面积（数据来自(j)）之间的相关性。所有数据均以均值 ± s.d 表示。P 值采用单因素方差分析 (ANOVA) 和非配对双侧学生 t 检验计算。源数据以源数据文件的形式提供。

图5 机械强化的细胞多层化和拥挤对于通过类似于降压的机制增强肠道组织出芽的启动至关重要。

a（上）具有代表性的 X-Z 切面显示了在μGSG（微图案肠球形发生器）中培养的肠道组织的结构，F-肌动蛋白染成绿色，细胞核染成蓝色。白色虚线勾勒出 F-肌动蛋白皮层的屈曲结构。在 n = 3 个独立实验中也出现了类似结果。(下图）上图所示的组织结构示意图，该示意图用于对拥挤引起的压缩应变下的组织屈曲进行有限元分析（详细说明见方法）。c 分别为单层组织（ht = 15 μm）和多层组织（ht = 30 μm）在不同压缩应变下的组织变形等值线。y 方向（U2）的位移场用颜色标示，如色标所示。源数据以源数据文件的形式提供。

图6 机械强制的细胞多层化和拥挤足以增强肠球体的生物生成。

a 在单层（上）、划痕-撕裂（SR，中）和划痕-清除（SC，下）试验中诱导后前肠球形细胞的示意图。图中还显示了在所述条件下细胞培养第 4 至 7 天的代表性相衬图像。红色虚线表示划痕区域的边界。黑色箭头表示细胞多层化。黑色、红色和蓝色矩形标记放大图像中显示的区域。比例尺：200 μm。b 具有代表性的共聚焦显微照片，分别显示 SR 和 SC 试验中细胞培养第 5 天的划痕区域和完整区域的 X-Y 和 X-Z 切面。DAPI 染色细胞核，小麦胚芽凝集素（WGA）染色细胞膜。缩放条：c 散点图分别显示 SR 和 SC 检测中划痕区域和完整区域的菌落厚度。所有数据均以均数 ± s.d 表示。P 值采用非配对双侧学生 t 检验计算。原始数据作为原始数据文件提供。

主动相场模型再现了单分散肠球体裂变的不稳定性驱动形态力学原理

研究团队使用了一种基于主动相场方法的理论框架，对肠道球体的裂变机制进行了定量分析。研究发现，肠道球体的裂变是由一种基于不稳定性的机制驱动的，这种机制依赖于肌动蛋白机械装置和组织表面的张力积累，以控制不同形态状态之间的机械敏感性转换。主动相场模型可以模拟组织的流体样变形，通过描述一个标量场来模拟组织的运动和变形，从而再现了肠道球体裂变的不稳定性驱动形态力学原理。

图7 单分散肠球体裂变基于不稳定驱动的形态力学。

a-c 框图显示不同直径 d 的单层和圆形 μGSG（微图案肠球体发生器）产生的后前肠球体的小轴长度 w（a）、长宽比 l/w（b）和投影面积 A（c）（框：25% - 75%，框内条：中位数，须：5% 和 95%）。n=3个独立实验。 d（上）代表性共焦显微照片，显示在相应条件下，在μGSG中形成的突起的前裂变组织柱中，F-肌动蛋白、磷酸化肌球蛋白轻链（pMLC）和细胞核（DAPI）染色的X-Y切片。白色箭头表示 F-肌动蛋白和 pMLC 在组织外表面的聚集。(中）从分裂前组织柱中选取具有代表性的组织芽（前瞻性球状体形成区域；以红色和品红色矩形标记）并在放大图像中显示。(下图）F-肌动蛋白和 pMLC 沿所选组织芽直径的荧光强度（放大图像中的白线）。黑色箭头表示所选组织芽外组织表面的位置，黑色箭头表示内/腔组织表面的位置。缩放条：e 组织柱球体形态发生的活动相场模型示意图，其特点是 F-肌动蛋白和 pMLC 的定向聚集以及由此产生的组织外表面的张力（详细说明见正文和方法）。 f 球体裂变的模拟结果，显示组织屈曲和随后组织裂变的开始。白色箭头表示具有代表性的裂变点。g 活跃相场模型预测的球粒大小的概率密度分布。源数据作为源数据文件提供。

肠球体形态发生的生物力学相图

研究团队绘制了肠球体形态发生的生物力学相图。在这个相图中，通过对不同参数的模拟结果进行分析，研究团队发现了三种不同的形态状态：平滑状态、珠状状态和裂变状态。其中，平滑状态表示组织没有发生变形，珠状状态表示组织表面出现了波浪形变形，但是没有完全裂变，裂变状态表示组织表面出现了颈部收缩，最终裂变成为多个独立的肠球体。这个生物力学相图显示了肠球体形态发生的机械敏感性转换，即肠球体的形态状态取决于组织表面张力的大小和肌动蛋白机械装置的累积程度。

图8 肠球体裂变的生物力学相图。

a 不同球粒形态发生状态的相图。(插图）模拟结果分别代表了表面张力受损（表面张力抑制）或张力正常（正常）时的球形体形态发生。 b（上）代表性共聚焦显微照片，显示了经 Y27632 处理的微图案化肠道球形体发生器中形成的突起的前裂变组织柱中 F-肌动蛋白、磷酸化肌球蛋白轻链（pMLC）和细胞核（DAPI）染色的 X-Y 切面图。(右上）从分裂前组织柱中选取具有代表性的组织芽（预期球形形成区域），并在放大图像中显示。(右下图）F-肌动蛋白和 pMLC 沿所选组织芽直径的荧光强度（放大图像中的白线）。黑色箭头表示所选组织芽的外组织表面位置，黑色箭头表示内/腔组织表面位置。缩放条：100 μm。c 小提琴图显示第 7 天在指定条件下裂变前组织柱腔内和外表面 F 肌动蛋白和 pMLC 的平均荧光强度。n=3个独立实验。 d（左）代表性相图显示第7天在指定条件下从上清液中移除所有容易形成的球体后，仍附着在微图案肠球体发生器上的后前肠组织。比例尺：400 μm。(右图）红色虚线方框标示出可放大的菌落。 f 代表性相图显示在指定条件下从μGSG 中收集的易形成球体。缩放条：500 μm。g 在指定条件下生成的球体的归一化数量。n = 4 个独立实验。 h 代表性相位图像显示在指定条件下从μGSG 收集的易形成球体。缩放条：i 指定条件下生成的球体数量的归一化。n = 3 个独立实验。P 值采用非配对、双侧 Student's t 检验计算。源数据作为源数据文件提供。

总结

本文的研究结果表明，微模式几何不敏感、机械强制的细胞多层化和拥挤是增强肠道球状生物生成的必要条件和充分条件。同时，研究团队还发现了肠道球体裂变的不稳定性驱动形态力学原理，并绘制了肠球体形态发生的生物力学相图。这些研究结果对于深入理解肠道球体形态发生的机制具有重要的意义，为未来开发肠道组织工程和肠道疾病治疗提供了新的思路和方法。

参考信息

Mechanically enhanced biogenesis of gut spheroids with instability-driven morphomechanics.Nat Commun. 2023 Sep 27;14(1):6016. doi: 10.1038/s41467-023-41760-2.PMID: 37758697IF: 16.6 Q1 PMCID: PMC10533890IF: 16.6 Q1 .